Nicole de Boer begann ihre spätere Schauspielkarriere bereits in ihrer Kindheit mit Theaterauftritten und Werbespots. Mit elf Jahren hatte sie ihren ersten Auftritt in einem Fernsehfilm. Ab Mitte der 1980er-Jahre folgten Auftritte in verschiedenen – zumeist kanadischen – Independent-Filmen und Serien, darunter auch einige Episoden der erfolgreichen kanadischen Sketch-Reihe Kids in the Hall und dem Kino-Ableger Brain Candy.

1997 war sie in einer Hauptrolle in der kanadischen Science-Fiction-Serie Deepwater Black zu sehen sowie im von der Kritik positiv aufgenommenen Low-Budget-Thriller Cube, der auf dem Toronto Film Festival im gleichen Jahr den Preis als bestes kanadisches Erstlingswerk gewann.

Von 1998 bis 1999 spielte de Boer in der siebten und letzten Staffel der Science-Fiction-Serie Star Trek: Deep Space Nine die Rolle der Ezri Dax. Von 2002 bis 2007 stand sie für die auf Stephen Kings Erfolgsroman Dead Zone – Das Attentat basierende US-amerikanische Fernsehserie Dead Zone in der weiblichen Hauptrolle der Sarah Bannerman vor der Kamera. Ferner hatte sie 2008 einen Gastauftritt in der fünften Staffel der Science-Fiction-Serie Stargate Atlantis (Folge: Geflüster) als Dr. Alison Porter.